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    Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder Isolierung von in einer Lösung oder Suspension enthaltenen hochmolekularen Verbindungen, wie hochmolekulare Proteine oder proteinartige Verbindungen, mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung von Metallionen-enthaltender Membranen.
    公开号:DE102004004043A1
    申请号:DE200410004043
    申请日:2004-01-27
    公开日:2005-08-18
    发明作者:Wolfgang Dr. Demmer；Mariel Dr. Donzeau；Matthias Dr. Grabosch；Wolfgang Dr. Nagel；Peter Reichelt；Oscar-Werner Dr. Reif
    申请人:APANOVIS BIOTECHNOLOGIE GmbH；Sartorius AG；
    IPC主号:C07K1-22
    专利说明:
    [0001] Dievorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung und/oderIsolierung von in einer Lösungoder Suspension enthaltenen hochmolekularen Verbindungen, wie hochmolekulareProteine oder proteinartige Verbindungen, mittels Affinitätschromatographieunter Verwendung von Metallionen-enthaltender Membranen.
    [0002] ChromatographischeVerfahren spielen bei der Aufreinigung und Isolierung von Proteinenoder proteinartigen Verbindungen, insbesondere bei Verwendung alsImpfstoff, eine wichtige Rolle. Beispielsweise werden im Stand derTechnik affinitäts-chromatographischeVerfahren zur Reinigung von rekombinanten Bakteriophagen beschrieben,die jedoch unter anderem nachteiligerweise eine sehr geringe Bindungskapazität des verwendetenChromatographiematerials aufweisen (vgl. Bass et al., 1990; McCaffertyet al., 1991; US 5,750,373 ; US 5,688,666 ; WO 92/09690).
    [0003] Sowird bei der Herstellung von filamentösen Bakteriophagen, die aufihrer Oberflächerekombinante Proteine tragen bzw. exprimieren, wobei solche rekombinantenProteine z.B. Antigene fürden Einsatz als therapeutische Vakzine gegen Krebserkrankungen oderAutoimmunkrankheiten, oder Antigene für den Einsatz von prophylaktischenVakzinen gegen Infektionskrankheiten, sein können, in den meisten Fällen einGemisch aus Bakteriophagen erhalten, die viele, wenige oder keinerekombinanten Proteine tragen, wobei es sich in letztem Fall um Wildtyp-Bakteriophagenhandelt. Je nach verwendetem Antigen wird eine unterschiedlich guteExpression des Antigens erhalten. Dies bedeutet, daß der Anteilder Phagen, die Antigene tragen, je nach verwendetem Antigen unterschiedlichhoch sein kann. Im Gegensatz zu anderen viralen Partikeln, die meist selbstdas Antigen darstellen, gibt es folglich bei der Herstellung vonrekombinanten Bakteriophagen ein besonderes Problem, nämlich dieAbtrennung der Wildtyp-Bakteriophagen von den gewünschtenBakteriophagen, die das rekombinante Protein, beispielsweise einAntigen, auf der Oberflächetragen. Bei der Verwendung von rekombinanten Phagenimpfstoffen kommtes unter anderem auf die Dichte des rekombinanten Antigens an, dasauf der Oberflächedes Phagen exprimiert wird, denn das eigentliche Ziel der Immunisierungist eine spezifische Immunantwort gegen das exprimierte rekombinanteAntigen zu induzieren. Die Wildtyp-Bakteriophagen können hierbeiinterferierend wirken, da nicht die Immunantwort gegen den Bakteriophagendas Ziel ist, sondern eine Immunantwort gegen die "fremden" Antigene, die aufdem Phagen exprimiert werden. Durch hohe Verunreinigungen mit Wildtyp-Bakterienphagen wirddas Verhältniszwischen Immunreaktion gegen das Antigen und Immunreaktion gegenden Phagen schlechter. Darum ist es wünschenswert, die Bakteriophagenaufzureinigen, die das gewünschteAntigen auf der Oberflächeaufweisen und die unerwünschtenWildtyp-Bakteriophagen abzutrennen.
    [0004] Fernerist es inbesondere bei rekombinanten Impfstoffen wünschenswert,kontaminierende Molekülejeglicher Art insbesonders Proteine und Endotoxine des für die Herstellungder rekombinanten Impfstoffe verwendeten Wirtsorganismus, beispielsweise E.coli oder Säugerzellen,und potentiell kontaminierende Proteine und niedermolekulare Verbindungen, wieAntibiotika, Cytokine etc., aus dem Kulturnährmedium von z.B. Bakterienoder Säugerzellenvon den rekombinanten Impfstoffen abzutrennen, um eine möglichsthohe Reinheit zu erzielen.
    [0005] Eineweitere wichtige Anforderung an das Reinigungsverfahren für gentechnologischhergestellte Proteine, (Poly)peptide oder rekombinante Bakteriophagen,welche als Impfstoffe verwendet werden können, ist die großtechnischeHerstellbarkeit, damit solche Mengen an beispielsweise rekombinantenBakteriophagen produziert werden können, die zur Anwendung beimMenschen ausreichend sind.
    [0006] Diestrukturellen Eigenschaften von partikulären Substanzen, wie MultimereProteinkomplexe, Multienzymkomplexe, rekombinante Viren, VLP's und Bakteriophagen,stellen ein Problem fürherkömmlicheAufreinigungsmedien auf Partikelbasis dar, wobei sich derartigeSubstanzen durch solche Medien auf Partikelbasis nicht oder nursehr schlecht aufreinigen lassen. Am nachfolgenden Beispiel von filamentösen Bakteriophagenwird dies deutlich.
    [0007] Fd-Phagenweisen eine ungewöhnliche Form(z.B. hat der fd-Phage einen Durchmesser von 6 nm und eine Länge vonbis zu 900nm) mit einem Molekulargewicht von etwa 15×106 Dalton auf, was spezielle Anforderungenan die Reinigung stellt. In der PCT/EP99/03380 ist ein Verfahrenzur Herstellung von Phagenvakzinen gegen Tumoren beschrieben. DieseVakzine werden bereits mit gutem Erfolg eingesetzt, es wäre jedochwünschenswert,das darin beschriebene Herstellungsverfahren für den großtechnischen Einsatz weiterzu vereinfachen.
    [0008] Dervorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahrenbereitzustellen, welches eine kostengünstige und schnelle Konzentrierung,Aufreinigung und/oder Isolierung von hochmolekularen Verbindungen,wie hochmolekulare Proteine oder proteinartige Verbindungen, beispielsweisefilamentöse,nicht natürlicherweiseauf der Oberflächevorkommende Antigene tragende Bakteriophagen, insbesondere im großtechnischenMaßstab ermöglicht.
    [0009] DieseAufgabe wird durch Bereitstellung der in den Ansprüchen gekennzeichnetenAusführungsformengelöst.
    [0010] Insbesonderewird ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder Isolierung von in einerLösungoder Suspension enthaltenen hochmolekularen Verbindungen, wie hochmolekulareProteine oder hochmolekulare proteinartige Verbindungen, bereitgestellt, umfassenddie Schritte: (a) Aufbringen der Lösung oderSuspension auf eine Metallionen-enthaltende Membran und (b) affinitätschromatographischeAbtrennung der hochmolekularen Verbindungen durch deren Bindungan die Metallionen-enthaltende Membran, wobei die hochmolekularenVerbindungen die Fähigkeitzur Metallchelat-Bildung aufzeigen und vorzugsweise ein Molekulargewichtvon größer als1×106 Da, mehr bevorzugt größer als 2×106 undbesonders bevorzugt größer 5×106 Da aufweisen.
    [0011] Diehochmolekularen Verbindungen, wie Proteine oder proteinartige Verbindungen,lassen sich aufgrund ihrer Größe und/oderForm überherkömmlichesChromatographiematerial, wie modifizierte Agarose, z. B. Sepharose®,im wesentlichen nicht aufreinigen und/oder isolieren. Beispielsweise können Vireneine icosahedrale, helikale oder komplexe Form aufweisen und behüllt oderunbehüllt sein,wobei Viren beispielsweise eine Größe von etwa 10 nm bis etwa100 nm aufweisen. In besonderen Fällen sind Viren stäbchenförmig undweisen eine Längevon mehreren hundert Nanometern auf. Beispielsweise hat der PhageM13 eine Längevon etwa 900 nm. Insbesondere könnenbei einer gelchromatischen Auftrennung bzw. Isolierung die hochmolekularenVerbindungen im wesentlichen nicht in das heteroporöse gequolleneNetzwerk der Perlen bzw. „Beads" (wie beispielsweiseSepharose®),die herkömmlicherweiseals stationärePhase in der Gelchromatographie verwendet werden, eindringen.
    [0012] DerBegriff "Metallion(en)" unterliegt keiner besonderenEinschränkung,insoweit die verwendeten Metallionen eine spezifische Affinität zu denzu reinigenden und/oder zu isolierenden Proteinen oder proteinartigenVerbindungen aufweisen. Bevorzugte Metallionen sind aus der Gruppe,bestehend aus Cu2+, Ni2+,Zn2+, Co3+, Fe3+, Mn2+ und Ca2+ und Gemischen aus mindestens zwei dieserMetallionen, ausgewählt.Besonders bevorzugt ist das Metallion Cu2+.
    [0013] DasMatrixmaterial der erfindungsgemäß verwendetenMembran unterliegt keiner besonderen Einschränkung und ist vorzugsweiseausgewähltaus der Gruppe, bestehend aus Agarosen, modifizierten Agarosen,modifizierten Dextranen, Polystyrolen, Polyethern, Polyacrylamiden,Polyamiden, z.B. Nylon, Cellulose, modifizierten Cellulosen wievernetzten Cellulosen, Nitrocellulosen, Celluloseacetaten, Silikatenund Poly(meth)acrylaten, Polytetrafluorethylen, Polyestern, Polyvinylchloriden,Polyvinylidenfluorid, Polypropylen, Polysulfonen und Polyethersulfonen.Die Porengröße der erfindungsgemäß verwendeten Membranliegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 12 μm, bevorzugt von 0,45 bis 7 μm, besondersbevorzugt von 3 bis 5 μm.
    [0014] DerBegriff „hochmolekulareVerbindungen" umfaßt hochmolekulareProteine und hochmolekulare proteinartige Verbindungen sowie Biopolymere,Lipide, Mizellen und Liposomen.
    [0015] DerBegriff "proteinartigeVerbindung(en)" umfaßt (Poly)peptideund Derivate davon, derivatisierte Proteine, rekombinante Proteineund (Poly)peptide, Di-, Tri-, Tetra-, bis Multimere von Peptiden,Polypeptiden oder Proteinen, (Multi)proteinkomplexe, Zellorganelle,Fusionsproteine, Viren und Teile davon, wie beispielsweise Hüllproteine,rekombinante Viren und Teile davon, rekombinante Bakteriophagen,wie beispielsweise rekombinante filamentöse Bakteriophagen, und Teiledavon, die auf ihrer Oberflächenicht natürlicherweisevorkommende Antigene tragen. In einer bevorzugten Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrenswerden rekombinante, filamentöseBakteriophagen als proteinartige Verbindungen aufgereinigt und/oderisoliert.
    [0016] DerBegriff "filamentöser Bakteriophage" umfaßt im Sinneder vorliegenden Erfindung sämtliche Phagen,welche eher helikale als eikosaedrische Symmetrie aufweisen. DerfilamentöseBakteriophage kann ein Klasse I-Phage, wie z.B. fd-, M13-, f1-, If1-,Ike-, ZJ/Z- oder Ff-Phage sein oder ein Klasse II-Phage, wie z.B. Xf-, Pf1- oder Pf3-Phage sein. In einer besonders bevorzugtenAusführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrensist die proteinartige Verbindung der filamentöse Bakteriophage M13.
    [0017] Unter "nicht natürlicherweisevorkommende Antigene" imZusammenhang mit dieser Erfindung werden Antigene, wie z.B. Proteine,verstanden, die nicht in den Capsiden der Wildtyp-Formen filamentöser Bakteriophagenvorkommen. Es handelt sich hierbei um Antigene, welche rekombinantdurch den Phagen exprimiert und in das Capsid eingebaut werden können, oderwelche chemisch beispielsweise an das Capsid gebunden werden können.
    [0018] Ineiner weiteren bevorzugten Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrensist das rekombinante exprimierte Protein auf dem Bakteriophagenein Fusionsprotein mit dem Protein III und/oder dem Protein VIIIdes Bakteriophagens.
    [0019] DasAntigen muß einFusionsprotein mit einem Phagenprotein sein, wenn es auf dem Phagen rekombinantexprimiert werden soll. Sonst kann es nicht eingebaut werden. ImFalle des Proteins III reicht auch ein Teil dieses Proteins aus,da sich dieses am Kopf des Phagen befindet und nur an einem Endemit dem Phagen verbunden ist. Beim Protein VIII ist das gesamteProtein notwendig, weil sonst kein Einbau in den Phagen erfolgenkann (p VIII ist relativ klein und bildet die Hülle des Phagen). Der Vorteildes Einbaues des Antigens durch rekombinante Expression als Fusionsproteinist, daß diePräsentationauf der Phagenoberflächegerichtet bzw. genau definiert ist.
    [0020] Unter "Aufreinigung vonhochmolekularen Verbindungen, wie Proteine oder proteinartige Verbindungen,beispielsweise rekombinante, filamentöse Bakteriophagen", ist im Sinne dieserErfindung zu verstehen, daß mindestens97%, vorzugsweise mindestens 98%, besonders bevorzugt mindestens99% und am meisten bevorzugt mindestens 99,8% der durch das Verfahrenzu reinigenden Proteine oder proteinartigen Verbindungen vorliegen.
    [0021] Unter "Isolierung von hochmolekularenVerbindungen, wie Proteine oder proteinartige Verbindungen, beispielsweiserekombinante, filamentöse Bakteriophagen" ist in dieser Erfindungzu verstehen, daß alledurch das Verfahren gereinigten hochmolekularen Verbindungen imwesentlichen rein sind. Vorzugsweise enthalten die isolierten hochmolekularen Verbindungenkeine kontaminierenden Proteine, wie beispielsweise im Fall vonisolierten Bakteriophagen keine kontaminierenden E. coli-Proteine,und/oder keine Nährmediumbestandteilemehr.
    [0022] Ineiner bevorzugten Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrenswerden rekombinante, Antigen-tragende Bakteriophagen aufgereinigt und/oderisoliert, wobei es überraschenderweise möglich ist,mindestens 1×1013 Antigentragende Bakteriophagen pro 50bis 100 cm2 Membranfläche aus einem Gemisch, welchessowohl Wildtyp-Bakteriophagen als auch Antigen-tragende Bakteriophagen enthält, aufzureinigenund/oder zu isolieren.
    [0023] Aufgrundder überraschenderweisehohen Menge an aufgereinigtem Material pro Flächeneinheit der Membran kombiniertmit der hohen Reinheit, welche die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgereinigtenund/oder isolierten hochmolekularen Verbindungen, wie Proteine oderproteinartige Verbindungen, aufweisen, ist es möglich, diese in großtechnischemMaßstabals Impfstoffe herzustellen und einzusetzen. Das trifft insbesonderefür dierekombinanten Bakteriophagen zu. Die unerwarteten Vorteile der Erfindungzeichnen sich besonders durch eine im Tierversuch wesentlich höhere Wirksamkeitim Vergleich zu den nicht gereinigten Bakteriophagen aus. Die Erprobungder Wirksamkeit eines Impfstoffes sind dem Fachmann bekannt undsomit Stand der Technik.
    [0024] DasPrinzip der Metallionen-Affinitätschromatographieberuht auf der Metallchelat-Bildung bzw.Komplexbildung zwischen Metallionen wie Cu2+, Ni2+, Zn2+ und Co3+, und dem zu reinigenden Protein, welchesvorzugsweise eine Abfolge von 5 bis 6 Histidinresten ("His-Tag") oder mehrer solcherEinheiten hintereinander, aufweist. Das Metallion kann über einenweiteren Komplexbildner an die Membranmatrix gekoppelt sein. DasPrinzip dahinter ist, dass viele Metalle, wie Kupfer und Zink, undderen Ionen Koordinationskomplexe mit den Aminosäuren Histidin, Cystein undTryptophan überElektronendonatorgruppen der Seitenketten der Aminosäuren bilden können. Umdiesen Effekt fürdie Chromatographie nutzen zu können,müssendiese Metallionen auf einer inerten Matrix immobilisiert werden.Dies kann durch Aufbringen einer chelatbildenden Gruppe auf dieMatrix erreicht werden. Von besonderer Bedeutung ist zum Gebrauchsolcher Gruppen, dass sie auf der Matrix fixiert sind und eine hoheAffinitätzur zu reinigenden Substanz aufweisen. Der gebräuchlichste chelatbildende Ligandin dieser Art der Chromatographie ist Iminodiessigsäure (IDA).Sie bildet ein Chelat (mehrfache Koordinationsstellen) mit Metallen.Die gebräuchlichstenMetalle sind Kupfer und Zink, aber auch andere, wie Kobalt, Nickel,Eisen, Lanthan, Mangan und Calcium sind beschrieben worden. DerHis-Tag kann sich im Protein am N-Terminus, am C-Terminus oder auchintern befinden. Das Besondere bei der erfindungsgemäßen Reinigungvon rekombinanten Bakteriophagen ist, daß es sich dabei nicht um eineinzelnes Protein handelt, sondern um einen Phagenpartikel, dasaus tausenden Proteinen besteht oder um Phagenpartikelfragmente,die aus kleineren Multimeren bestehen und eine sehr ungewöhnlicheForm besitzen.
    [0025] Ein "Tag" im Sinne der Erfindungist ein Bindungspartner, welcher mit dem zu reinigenden Proteinoder proteinartigen Verbindung ein Fusionsprotein bildet, wobeidie spezifische Interaktion dann zwischen dem Tag und einem für den Tagspezifischen Metallion stattfindet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrensist der Tag ausgewähltaus der Gruppe, bestehend aus His-Tag, Flag-Tag und Myc-Tag.
    [0026] Weiterhinsind nativ auftretende Proteinmotive mit Metallchelateigenschaften,wie z.B. sog. Zinkfingermotive von Transkriptionsfaktoren als tagsim Sinne der Erfindung zu verstehen, da sie in der Lage sind, einespezielle Interaktion mit Metallionen auszuführen.
    [0027] DieForm der erfindungsgemäß verwendeten Metallionen-enthaltendenMembran unterliegt keiner besonderen Einschränkung und sie kann in einem Gehäuse, beispielsweiseeinem Kunststoffgehäuse odereiner Chromatographiesäuleangeordnet sein. Bevorzugt ist eine flächige Ausbildung der MetallionenenthaltendenMembran, wobei in einer Packung für eine Chromatographie-Säule mehrereLagen der Metallionen-enthaltenden Membran übereinander angeordnet seinkönnen.
    [0028] Indem erfindungsgemäßen Verfahrenkann vor Schritt (a) ein die zu reinigenden und/oder isolierendenhochmolekularen Verbindungen enthaltendes Gemisch einer Ionenaustauscherchromatographie zurEntfernung von Verunreinigungen unterzogen werden. Vorzugsweisewird die Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung einerionenaustauschermembran durchgeführt.Die Ionenaustauschermembran umfaßt vorzugsweise ein Matrixmaterial,ausgewähltaus der Gruppe, bestehend aus Agarosen, modifizierten Agarosen,modifizierten Dextranen, Polystyrolen, Polyethern, Polyacrylamiden,Polyamiden, z.B. Nylon, Cellulose, modifizierten Cellulosen wievernetzten Cellulosen, Nitrocellulosen, Celluloseacetaten, Silikatenund Poly(meth)acrylaten, Polytetrafluorethylen, Polyestern, Polyvinylchloriden,Polyvinylidenfluorid, Polypropylen, Polysulfonen und PolyethersulfonenDie Ionenaustauschermembran weist vorzugsweise eine Porengröße im Bereichvon 0,01 bis 12 μm,bevorzugt von 0,45 bis 7 μm,besonders bevorzugt von 3 bis 5 μmauf. Die funktionellen Gruppen der Ionenaustauschermembran unterliegenkeiner besonderen Einschränkungund sie sind beispielsweise entsprechend dem zu reinigenden Proteinoder der zu reinigenden proteinartigen Verbindung angepaßt. BevorzugteBeispiele fürfunktionelle Gruppen sind DEAE, DEA, CM, QA, TMA, S, SP und Phosphat-Gruppen.
    [0029] AlsBeispiele fürVerunreinigungen, die über Ionenaustauschchromatographie,z. B. durch Bindung an die Ionenaustauschmembran, entfernt werdenkönnen,sind insbesondere Endotoxine anzuführen, die beispielsweise beirekombinanter Herstellung von Proteinen oder proteinartigen Verbindungen wierekombinante filamentöseBakteriophagen, von dem Wirtsorganismus, z. B. E. coli, stammen.
    [0030] Esist ferner möglich,daß Verfahrenso zu optimieren, daß vorder Affinitätsmembranchromatographieund/oder vor der Ionenaustausch(membran)chromatographie möglichstviele Verunreinigungen beispielsweise durch im Stand der Technikbekannte Fällungsschritteoder im Stand der Technik bekannte Filtrationsschritte weiter reduziertwerden, um so den Kontaminationsgrad so gering wie möglich zuhalten. Dies reduziert die Wahrscheinlichkeit an unerwünschtenNebenwirkungen beim Einsatz als biologisch wirksame Substanz, insbesondereals Impfstoff.
    [0031] Ineiner bevorzugten Ausführungsformwird das Gemisch, welches beispielsweise das zu reinigende Proteinoder die zu reinigende proteinartige Verbindung, wie rekombinantefilamentöseBakteriophage enthält,vor der Affinitätsmembranchromatographieund/oder der Ionenaustausch(membran)chromatographie einer Filtrationunter Verwendung von im Handel erhältlichen Filtrationssysteme, wiedas Crossflow-Mikrofiltrationssystemsder Fa. Sartorius unterzogen. Dabei wird in einer geeigneten Einspannvorrichtungbeispielsweise eine Filterkassette mit einer Hydrosart®-Membranmit einer nominellen Porenweite von 0,45 μm oder 0,2 μm verwendet. Der Betrieb solcherSysteme ist dem Fachmann bekannt. Durch die Filtration können weitereVerunreinigungen, wie der Wirtsorganismen oder Bestandteilen davon,entfernt werden. Das so erhaltene Filtrat kann dann, gegebenenfallsnach geeigneter, herkömmlicherAufbereitung, fürdie Ionenaustauschchromatographie und/oder Affinitätsmembranchromatographieeingesetzt werden.
    [0032] Daserfindungsgemäße Verfahrenkann als "batch"-Verfahren oder kontinuierlichdurchgeführt werden.
    [0033] Ineiner weiteren bevorzugten Ausführungsformumfaßtdas erfindungsgemäße Verfahrendie Weiterformulierung der aufgereinigten und/oder isolierten hochmolekularenVerbindung, z. B. ein Protein oder eine proteinartige Verbindung,als Impfstoff. Beispielsweise werden Phagen nach der Reinigung gegenPBS dialysiert und anschließendwerden die Proteinkonzentration, die PFU, die Endotoxinkonzentrationund die Antigenmenge bestimmt. Vorzugsweise werden die Endotoxinkonzentrationund die Antigenmenge mit dem LAL-Test bzw. mit einem Immun-Dot-Blotbestimmt. Die Konzentration wird durch Verdünnung auf das gewünschte Maß eingestellt.
    [0034] Ineiner weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahrenunter GMP-Bedingungen durchgeführt,wobei GMP "goodmanufacturing practice" bedeutetund dem Fachmann bekannt und somit Stand der Technik ist.
    [0035] Einweiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendungder erfindungsgemäß hergestelltenhochmolekularen Verbindungen, wie Proteine oder proteinartige Verbindungen,vorzugsweise rekombinante filamentöse Bakteriophagen, als biologischbzw. pharmakologisch wirksame Bestandteile in einer pharmazeutischenZusammensetzung, beispielsweise einen Impfstoff, welche gegebenenfallseinen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oderVerdünnungsmittelumfaßt.Beispiele geeigneter Trägeroder Verdünnungsmittelsind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Phophat-gepufferte Salzlösungen,Wasser, Emulsionen wie z.B. Öl/Wasseremulsionen,verschiedene Arten von Netzmitteln oder Detergenzien, sterile Lösungen, etc.Zusammensetzungen, die solche Träger und/oderVerdünnungsmittelumfassen, könnenmittels bekannten herkömmlichenVerfahren hergestellt werden.
    [0036] Diepharmazeutischen Zusammensetzungen können einem Individuum in geeigneterDosierung verabreicht werden. Eine Verabreichung kann oral oderparenteral erfolgen, z.B. auf intravenösem, intraperitonealem, subkutanem,perinodalem, intramuskulärem,topischem, intradermalen, intranasalem oder intrabronchialem Wegoder übereinen Katheder in eine Arterie. Die Höhe der Dosierung wird von dembehandelnden Arzt bestimmt und hängtim wesentlichen von den klinischen Faktoren ab. Diese Faktoren sindim Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise die Körpergröße bzw.das Gewicht, die Körperoberfläche, dasAlter, das Geschlecht und den allgemeinen Gesundheitszustand desPatienten, die spezielle zu verabreichende Zusammensetzung, dieBehandlungsdauer, die Art der Verabreichung und die eventuelle gleichzeitigeBehandlung mit einem anderen Arzneimittel. Eine typische Dosis kannz.B. in einem Bereich zwischen 0,001 und 5000 μg liegen, wobei Dosen unterhalb oderoberhalb dieses beispielhaften Bereiches, vor allem unter Berücksichtigungder oben erwähnten Faktoren,vorstellbar sind. Im allgemeinen sollte sich bei regelmäßiger Verabreichungder erfindungsgemäßen Zusammensetzungdie Dosis in einem Bereich zwischen 1 μg- und 10 mg-Einheiten pro Tag befinden. Wird dieZusammensetzung intravenös verabreicht,was nicht bevorzugt empfohlen wird, um die Gefahr einer anaphylaktischenReaktion zu minimieren, sollte sich die Dosis vorzugsweise in einem Bereichvon etwa 1 μgbis etwa 10 mg Einheiten pro kg Körpergewicht pro Minute befinden.
    [0037] Diepharmazeutische Zusammensetzung kann lokal oder systemisch verabreichtwerden. Präparatefür eineparenterale Verabreichung umfassen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen,Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nichtwässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol,Polyethylenglykol, pflanzliche Ölewie z.B. Olivenöl,und organische Esterverbindungen wie z.B. Ethyloleat, die für Injektionengeeignet sind. WässrigeTrägerumfassen Wasser, alkoholische wässrigeLösungen,Emulsionen, Suspensionen, Salzlösungenund gepufferte Medien. Parenterale Träger umfassen Natriumchlorid-Lösungen,Ringer-Dextrose, Dextrose, Natriumchlorid, Ringer-Laktat und gebundene Öle. Intravenöse Träger umfassenz.B. Flüssigkeits-,Nährstoff-, undElektrolyt-Ergänzungsmittel(wie z.B. solche, die auf Ringer-Dextrose basieren). Die erfindungsgemäße Zusammensetzungkann außerdemKonservierungsmittel und andere Zusätze umfassen, wie z.B. antimikrobielleVerbindungen, Antioxidantien, Komplexbildner und inerte Gase. Desweiteren können, abhängig vonder beabsichtigten Verwendung, Verbindungen wie z.B. Interleukine,Wachstumsfaktoren, Differenzierungsfaktoren, Interferone, chemotaktischeProteine oder ein unspezifisches immunmodulatorisches Agens erhaltensein.
    [0038] DieFiguren zeigen:
    [0039] 1 zeigteine graphische Darstellung der Wasch- und Elutionsschritte einerIonenaustausch-Chromatographie. Das erste Signal enthält die Hauptfraktionvon Endotoxinen und das zweite Signal enthält im wesentlichen die Phagen.Die gestrichelte Linie stellt den NaCl-Gradienten dar.
    [0040] 2 isteine photographische Abbildung eines Dot-Blots hinsichtlich derAufreinigung von rekombinanten M13/fd-Phagen mit His-Tag/g8-Fusionsproteinen,wobei zur immunologischen Detektion monoklonale Peroxidase-konjugierte/Anti-polyhistidin-Antikörper verwendetwerden. Verdünnungsreihe vonlinks nach rechts: 1/100, 1/200, 1/400, 1/800; T=total; FT=Durchfluß; W1, W2,W3=jeweilige Waschschritte; E1, E2, E3=jeweilige Elutionsschritte; WT-Wildtyp-Phage(vgl. Beispiel 4).
    [0041] 3 isteine photographische Abbildung eines Dot-Blots hinsichtlich derAufreinigung von rekombinanten M13/fd-Phagen mit His-Tag/g8-Fusionsproteinen,wobei zur immunologischen Detektion monoklonale Peroxidasekonjugierte/Anti-polyhistidin-Antikörper verwendetwerden. Verdünnungsreihe vonlinks nach rechts: 1/100, 1/200, 1/400, 1/800; T=total; FT=Durchfluß; W1, W2,W3=jeweilige Waschschritte; E1, E2, E3=jeweilige Elutionsschritte; WT-Wildtyp-Phage(vgl. Beispiel 4). (A) Als Chromatopgraphiematerial werden im Handelerhältlich Ni2+-Agarosebeads verwendet. (B) Als Chromatographiematerialwird eine erfindungsgemäße Cu2+-enthaltende Membran verwendet.
    [0042] Dienachfolgenden Beispiele erläuterndie Erfindung ohne Beschränkungdes Schutzbereichs.
    [0043] 2L einer Bakteriophagen M13-Züchtung werdeneiner Cross-flow-Filtrationunter Verwendung einer Hydrosart-Membran (Porengröße 0,4 μm) von Sartoriusfiltriert.
    [0044] DieErgebnisse zeigen, dass mit der einstufigen Methode der Cross-flow-Filtration einPhagentiter von 8×104 Phagen/L erhalten werden kann, was ungefähr dem Ergebniseiner Isolierung der Phagen unter Verwendung der im Stand der Technikbekannten zweistufigen Methode „Zentrifugation und PEG/NaCl-Präzipitation" entspricht. Fernerkönnen mitder Cross-flow-Filtration Kontaminationen mit Bakterienzellen imwesentlichen verhindert werden. Somit wird mit der Cross-flow-Filtrationeine einfache und schnelle Methode zur Abtrennung von Phagen vonBakterienzellen bereitgestellt, die eine mindestens gleich guteAusbeute wie die im Stand der Technik bekannte Methode „Zentrifugationund PEG/NaCl-Präzipitation" liefert. Der Endotoxin-Gehaltder durch Cross-flow-Filtration erhaltenen Phagen entspricht ungefähr dem derMethode „Zentrifugationund PEG/NaCl-Präzipitation".
    [0045] 2mL einer 7 mg M13-Phagen enthaltenden Lösung, welche aus Beispiel 1stammt, werden einer Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendungeiner von Sartorius erhältlichenIonenaustausch-MembranQ75 bei 4°Cunterzogen. Die Bindung der Phagen an die Membran erfolgt mit einem Bindungspuffer(PBS, pH7). Zur Elution der ebenfalls an die Membran gebundene Endotoxinewird die Membran mit einem Waschpuffer (PBS, 0,1% (v/v) Triton X-114,pH7) gewaschen. Die an die Membran gebundenen Phagen werden danachmit einem Elutionspuffer (PBS, kontinuierlicher Gradient: 150 mM bis1 M NaCl, pH6) eluiert (vgl. auch 1). Dieeinzelnen Schritte der Ionenaustausch-Chromatographie werden durchBestimmung der Phagen (mittels quantitativem ELISA)- und Endotoxin(mittels LAL-Test)-Konzentrationen analysiert.
    [0046] Mitder Ionenaustausch-Chromatographie kann zwar eine Abreicherung derEndotoxine erhalten werden kann, aber eine vollständige Entfernung istnicht möglich.
    [0047] Dieregenerierte Cellulose ist durch Einführung bifunktioneller chemischerGruppen gegenüber enzymatischemund chemischem Abbau stabilisiert worden. Des weiteren wurden Polymethacrylatketten aufgepfropft,wobei die einzelnen Monomere jeweils eine Epoxygruppierung enthalten.An diese wurden chemisch Iminodiessigsäuregruppen gekoppelt. Die Membranist 275 +/– 27μm dick undweist eine Durchflussrate von mehr als 80ml/min·bar auf, wenn schwach gepuffertewässrigeSalzlösungenim pH-Bereich von 5 bis 9 verwendet werden. Die nominelle Porengröße liegtim Bereich von 3 bis 5 μm.
    [0048] Diein einem Kunststoffgehäuseangeordnete Membran wird mit einer 50 mL Spritze ohne Kolben verbundenund nacheinander mit 3 mL deionisiertem Wasser, 4 mL vorgefilterter0,3 M CuCl2-Lösung, 3 ml deionisiertem Wasserund 5 ml PBS behandelt bzw. gewaschen. Die so behandelte Membranist nun gebrauchsfertig füreine Affinitätschromatographie.
    [0049] 2mL einer M13/fd-Phagensuspension (in PBS), welche rekombinante Phagenmit His-Tag/g8-Fusionsproteinen auf der Oberfläche enthält, wird mit einer peristaltischenPumpe bei einer Flußratevon 0,25 mL/min auf die gemäß Beispiel3 erhaltene Cu2+-enthaltende Membran aufgebracht. DieMembran wird danach dreimal mit 5 mL PBS (W1, W2, W3) bei einerFlußratevon 0,5 mL/min gewaschen und anschließend werden die an die Membrangebunden rekombinanten Phagen nacheinander mit 2 mL 20 mM EDTA,2 mL 40 mM EDTA und 20 mL 80 mM EDTA jeweils bei einer Flußrate von 0,25mL/min eluiert (E1, E2, E3). Die affinitätschromatographische Aufreinigungwurde mit einem Dot-Blot unter Verwendung von monoklonalen Peroxidase-konjugierten/Anti-polyhistidin-Antikörpern analysiert.
    [0050] Wieaus 2 deutlich ersichtlich ist, werden die rekombinantenPhagen spezifisch an die Cu2+-enthaltendeMembran gebunden und mittels EDTA eluiert.
    [0051] Dieverwendete Membran kann durch ausreichendes Waschen mit 0,5 M EDTAzur Entfernung der Cu2+-Ionen, Waschen mitPBS/5% SDS in umgekehrter Richtung und ausreichendes Waschen mit deionisiertemWasser zur Entfernung von SDS wiederverwendet werden oder bei 4°C in einemversiegelten Behältnisgelagert werden.
    [0052] ImHandel erhältlicheNi2+-Agarosebeads (Fa. Amersham) werdengemäß dem Protokollder Herstellerin mit den in Beispiel 4 beschriebenen rekombinantenPhagen beladen, überNacht inkubiert und anschließendeluiert.
    [0053] AlsErgebnis ist festzuhalten, daß die über Ni2+-Agarosebeads (siehe Dot-Blot in 3(A) erzielte Aufreinigung von rekombinantenBeaktriophagen mit den Ni2+-Agarosebeads deutlichschlechter ist als die in 3(B) dargestellteAufreinigung mit der erfindungsgemäß verwendeten Cu2+-Membran.
    权利要求:
    Claims (16)
    [1] Verfahren zur Aufreinigung und/oder Isolierungvon in einer Lösungoder Suspension enthaltenen hochmolekularen Verbindungen mit derFähigkeitzur Metallchelat-Bildung, umfassend die Schritte: (a) Aufbringender Lösungoder Suspension auf eine Metallionenenthaltende Membran und (b)affinitätschromatographischeAbtrennung der hochmolekularen Verbindungen durch deren Bindungan die Metallionen-enthaltende Membran.
    [2] Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hochmolekularenVerbindungen ein Molekulargewicht von größer als 1×106 Daaufweisen.
    [3] Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die hochmolekularenVerbindungen aus der Gruppe, bestehend aus hochmolekularen Proteinen,hochmolekularen proteinartigen Verbindungen, hochmolekularen Biopolymeren,hochmolekularen Lipiden, Mizellen mit einem hohen Molekulargewichtund Liposomen mit einem hohen Molekulargewicht, ausgewählt sind.
    [4] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Metallionenaus der Gruppe, bestehend aus Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ , Fe3+, Mn2+ und Ca2+ und Gemischendavon, ausgewähltsind.
    [5] Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Metallion Cu2+ ist.
    [6] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Membranein Matrixmaterial, ausgewählt ausder Gruppe, bestehend aus Agarosen, modifizierten Agarosen, modifiziertenDextranen, Polystyrolen, Polyethern, Polyacrylamiden, Polyamiden, Cellulose,modifizierten Cellulosen wie vernetzten Cellulosen, Nitrocellulosen,Celluloseacetaten, Silikaten und Poly(meth)acrylaten, Polytetrafluorethylen,Polyestern, Polyvinylchloriden, Polyvinylidenfluorid, Polypropylen,Polysulfonen und Polyethersulfonen.
    [7] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die MetallionenenthaltendeMembran eine Porengröße im Bereichvon 0,01 bis 12 μm,bevorzugt von 0,45 bis 7 μm,besonders bevorzugt von 3 bis 5 μmaufweist.
    [8] Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die hochmolekularenproteinartigen Verbindungen aus der Gruppe, bestehend aus (Poly)peptidenund Derivaten davon, derivatisierten Proteinen, rekombinanten Proteinenund (Poly)peptiden, Di-, Tri-, Tetra-, bis Multimeren von Peptiden,Polypeptiden oder Proteinen, (Multi)proteinkomplexen, Zellorganellen,Fusionsproteinen, Viren oder Teilen davon, rekombinanten Viren oderTeilen davon und rekombinanten Bakteriophagen oder Teilen davon,ausgewähltsind.
    [9] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin vor Schritt(a) ein die hochmolekularen Verbindungen enthaltendes Gemisch einerIonenaustauschchromatographie zur Entfernung von Verunreinigungenunterzogen wird.
    [10] Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Ionenaustauschchromatographieunter Verwendung einer Ionenaustauschermembran durchgeführt wird.
    [11] Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Ionenaustauschermembranein Matrixmaterial, ausgewähltaus der Gruppe, bestehend aus Agarosen, modifizierten Agarosen,modifizierten Dextranen, Polystyrolen, Polyethern, Polyacrylamiden,Polyamiden, Cellulose, modifizierten Cellulosen wie vernetzten Cellulosen,Nitrocellulosen, Celluloseacetaten, Silikaten und Poly(meth)acrylaten,Polytetrafluorethylen, Polyestern, Polyvinylchloriden, Polyvinylidenfluorid,Polypropylen, Polysulfonen und Polyethersulfonen umfaßt.
    [12] Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Ionenaustauschermembraneine Porengröße im Bereichvon 0,01 bis 12 μm,bevorzugt von 0,45 bis 7 μm,besonders bevorzugt von 3 bis 5 μmaufweist.
    [13] Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die funktionellenGruppen der Ionenaustauschermembran aus der Gruppe, bestehend aus DEAE,DEA, CM, QA, TMA, S, SP und Phosphat-Gruppen, ausgewählt sind.
    [14] Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Verunreinigungenbakterielle Endotoxine, Nährmediumbestandteileund Verunreinigungen von Nährmediumbestandteilenumfassen.
    [15] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin vor Schritt(a) und/oder vor der Ionenaustauschchromatographie gemäß einemder Ansprüche9 bis 14 ein die hochmolekularen Verbindungen enthaltendes Gemischeiner Filtration unter Verwendung einer Filtrationsmembran zur Entfernungvon weiteren Verunreinigungen unterzogen wird.
    [16] Verwendung der gemäß einem der Ansprüche 1 bis15 aufgereinigten und/oder isolierten hochmolekularen Verbindungenals biologisch wirksame Bestandteile in einer pharmazeutischen Zusammensetzungwelche gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittelenthält.
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